دستگاه های سل کانتر یکی از پرکاربردترین و اصلی ترین تجهیزات آزمایشگاهی هستند. با این دستگاه می توان تعداد گلبول های قرمز(RBC)، گلبول های سفید (WBC) و پلاکت ها را اندازه گیری کرد. علاوه بر این برخی از این دستگاه ها قابلیت اندازه گیری هموگلوبین، هماتوکربت (MCV) ، MCH، MCHC، مرفولوژی گلبول های قرمز را نیز دارند و تعداد اندکی از آنها شمارش افتراقی سلول های سفید (شمارش تعداد لنفوسیت ها، مونوسیت ها و گرانولوسیت ها) را انجام می دهند.
وظیفه گلبول های قرمز انتقال اکسیژن و دی اکسید کربن بین بافت ها و ریه ها است. شمارش RBC، تعداد گلبول های قرمز را در یک میکرولیتر از خون نشان می دهد. پارامتر دیگر، HCT است که حجم سلول های خون را نسبت به حجم کل خون نمونه، بیان می دارد.
هموگلوبین در داخل گلبول های قرمز وجود دارد، که با اکسیژن موجود در ریه ها ترکیب شده و آن ها را به بافت منتقل می کند و در برگشت با دی اکسید کربن بافت ها ترکیب شده و از طریق ریه آن را از بدن خارج می کند. برای تعیین MCV، MCH و MCHC از معادلات استانداردی استفاده شده که مشخصه های گلبول قرمز خوانده شده و اطلاعاتی راجع به غلظت هموگلوبین و اندازه گلبول های قرمز خون فراهم می کنند. MCV حجم میانگین سلول های قرمز خون است. MCH وزن متوسط هموگلوبین را در یک سلول قرمز نشان داده و MCHC غلظت متوسط هموگلوبین را در سلول قرمز بیان می کند.
اصول کار دستگاه
سل کانترهای الکترونیکی که مشخصات خون را اندازه گیری می کنند به دو گروه اصلی تقسیم می شوند: گروه اول در هنگام عبور خون از مقابل یک منفذ، تغییرات امپدانس الکتریکی محلول را اندازه گیری می کنند و گروه دوم، بر مبنای شکست نور در اثر عبور سلول خون کار می کنند.
شمارنده سلول امپدانس الکتریکی
در این تکنیک ابتدا نمونه خون گرفته شده را با اضافه کردن داوری ضد انعقاد هپارینه کرده تا از به هم چسبیدن سلول ها و ایجاد خطا در اندازه گیری اجتناب شود. سپس با مکش خودکار حجم مشخصی از خون وارد دستگاه می شود. سپس، نمونه به نسبت ۱ به ۲۲۴ با محلولی که از نظر اسمزی با خون ایزوتونیک و بدون ذرات معلق است، رقیق می شود، در نهایت نمونه رقیق شده به دو قسمت تقسیم می شود. یک قسمت وارد محفظه شده و
قسمت دیگر که برای شمارش RBC استفاده خواهد شد، دوباره به یک محفظه رقیق کننده برگردانده می شود. به قسمتی از خون که برای شمارش WBC مورد استفاده می گیرد محلولی به نام ماده لیز کننده اضافه شده که غشاء سلول های قرمز را پاره کرده و هموگلوبین را آزاد می کند.
برای اندازه گیری هموگلوبین مقداری از محلول سیانید و پتاسیم فری سیانید، به عنوان ماده لیز کننده به نمونه اضافه می‌شود. سیانید آهن، آهن هموگلوبین را از حالت فرو ۲+ (Fe) به حالت + ۳ (Fe) تبدیل کرده و مت هموگلوبین ایجاد می‌کند که با سیانیدپتاسیم ترکیب می شود و رنگدانه پایدار “سیان مت هموگلوبین” را تولید می کند. چگالی نوری محلول با روش های اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شود و مقدار به دست آمده متناسب با غلظت هموگلوبین است.
پس از رقیق کردن نمونه ها، شمارش WBC,RBC و پلاکت با تکنیک امپدانس سنجی حجمی به دست می آید. برای شمارش سلول های قرمز نیز از همین روش استفاده می شود. محلول های شامل سلول ها وارد محفظه شمارش می‌شود. سپس حجم مشخصی از محلول متوسط پمپ خلاء و از طریق منفذ وارد لوله شمارش می شود. یک الکترود داخل لوله است و الکترود دیگر در محفظه شمارش قرار دارد. هنگامی که سلول از منفذ عبور می کند جریانی از محلول بدون سلول که از جلوی منفذ می گذرد، جریان الکتریکی ثابتی را بین دو الکترود به وجود می آورد و حجمی از محلول را برابر حجم خودش جابجا می کند. مقاومت سلول مفید خیلی بزرگتر از مقاومت مایع است. در نتیجه با عبور سلول خون، وقفه ای در جریان و یک پالس امپدانسی ایجاد می شود. دامنه پالس متناسب با حجم سلول است. پالس ها تقویت می‌شوند و پالس هایی که امپدانس آن ها بیشتر از یک سطح آستانه باشد، شمرده خواهند شد. برای افزایش دقت اندازه گیری، از سه واحد شمارش به صورت موازی استفاده می شود. این سه واحد، از یک محفظه شمارش و الکترود محفظه مشترک استفاده می کنند، ولی هر کدام لوله شمارش و الکترود لوله مخصوص خود را دارند. خروجی هر واحد تقویت می شود و از مدار آستانه عبور می کنند. ولتاژ آستانه در هنگام کالیبره کردن به دست می آید. پالس هایی که بیشتر از سطح آستانه هستند، وارد انتگرال گیر می شوند تا ولتاژ dc متناسب با تعداد WBC تولید شود. خروجی های سه مدار انتگرال گیر وارد مدار تصمیم گیری می شود. اگر سه خروجی در یک محدوده باشند، متوسط آنها گرفته می شود. اگر یکی از مقادیر، از دو مقدار دیگر مقدار خیلی دور باشد، در میانگین گیری به حساب نمی آید و اگر سه مقدار خروجی خیلی با یکدیگر تفاوت داشتند، خطا گرفته می شود و خروجی صفر خواهد بود. معمولا بیش از یک سلول در یک لحظه از جلوی منفذ عبور می کند که این امر باعث ایجاد خطا در شمارش می شود. در بیشتر آنالایزرها، با استفاده از روش های آماری این پدیده را پیش بینی و اصلاح می‌کنند.
شمارنده سلول لیزری
هنگامی که سلول ها از جلوی نور لیزر با طول موج خاص در حال عبور هستند، آشکارسازهای الکترونیکی، نور پراکنده شده از سلول را اندازه گیری می‌کنند. نوری که در جهت مستقیم پراکنده می شود همان طول موج نور تابش شده را دارد و شدت آن با اندازه ذره متناسب است. به این ترتیب که هر چه سلول بزرگ تر باشد، پراکندگی نور بیشتری وجود خواهد داشت و دتکتور FSC سیگنال بزرگ تری را به سمت قسمت الکترونیکی می فرستد. از آنجا که این نور به حد کافی قوی است برای شناسایی آن از فتودیود استفاده می‌شود
فرض هموژن بودن سلول ها در مورد RBC ها نسبتا صادق است، ولی برای WBC ها مناسب نیست و برای تعیین اندازه RBC ها نیز به دلیل متفاوت بودن اشکال آنها و تفاوت در محتوای هموگلوبین دچار محدودیت خواهیم شد. برای حل این مشکل در مورد RBC ها آنها را در محیط‌های با غلظت مناسب به شکل کره در آورده و شدت تفرق نور در زوایای مختلف را مقایسه می کنند. امروزه نسل جدید این سل کانترها قادر به اندازه گیری ۲۲ پارامتر مختلف هستند که مهم ترین قابلیت آنها افتراق ۵ زیر گروه سلولی گلبول های سفید است. دستگاه قادر به اندازه گیری ۱۰۰۰۰ سلول در هر نمونه است. اگر تعداد گلبول های سفید کوچک تر از ۱۰ کیلو بر میکرولیتر باشد، سیستم همان تعداد سلول ها را به عنوان WBC کلی شمارش خواهد کرد. این سیستم ها علاوه بر شمارش متداول سلول های خونی، قادر به انجام شمارش افتراقی سلول ها، محاسبه پارامترهای مرتب با اندازه سلول و مشخص کردن نمونه های غیر طبیعی هستند
لوله‌های حاوی نمونه توسط بازوی روباتیک مخلوط می شود. هر لوله پیش از نمونه برداری ۱۰ بار به صورت وارونه مخلوط می‌شود. علاوه بر این دستگاه قادر به نمونه برداری از نمونه های از پیش رقیق شده است. در برخی سیستم ها، نمونه وارد یک دریچه چرخشی شده که در آنجا تبدیل به پنج نمونه جداگانه می شود. یعنی حدود ۶ میکرولیتر خون کامل جهت اندازه گیری هموگلوبین و ۴ میکرولیتر برای تعیین اندازه سلول ها و شمارش RBC و پلاکت و ۱۲ میکرولیتر برای شمارش کل و شمارش افتراقی گلبول های سفید در محفظه های جداگانه قرار می‌گیرند. در برخی دیگر از مدل ها، هفت نمونه جدا می شوند که عبارتند از: ۳ میکرولیتر برای شمارش WBC و سه نمونه جداگانه برای شمارش افتراقی WBC و ۴/۲ میکرولیتر برای ارزیابی گلبول های نابالغ.
به طور خلاصه سیگنال های جمع آوری شده از قسمت های مختلف (فتودیودها و PMTها) تقویت شده به مرکز محاسبه سیستم الکترونیکی وارد می‌شوند. سپس با استفاده از کامپیوتر و نرم افزارهای نصب شده بر روی آن که هر یک برای انجام آزمایش خاصی طراحی شده اند، آنالیز داده ها انجام می شود. برخی از این نرم افزارها تنها برای انجام کارهای تحقیقاتی مناسب هستند، ولی در غیر این موارد نرم افزار تمامی امکانات لازم برای آنالیز داده ها، سنجش و شمارش آن ها را در اختیار کاربر قرار می دهد. در برخی از دستگاه ها برای شمارش افتراقی سلول های سفید از روش فلوسایتومتری استفاده می شود. در این روش مجموعه ای از اطلاعات مربوط به امپدانس متری و اطلاعات حاصل از نحوه پراکنده شدن نورلیزر تابانده شده به سلول‌ها برای به دست آوردن ساختار و اندازه سلول ها مورد استفاده قرار می گیرد.
دلایل خطا در شمارش گلبول های خون
خطا در جمع آوری یا نگهداری نمونه به شیوه نامناسب
نمونه گیری از بیمار دیگر
نمونه خون با برگه درخواست بیمار دیگر
رقیق بودن نمونه، مثلا نمونه از محلی گرفته می شود که در بالاتر از آن تزریق وریدی انجام می شود.
استفاده از EDTA بسیار غلیظ ( ایجاد چروکیدگی گلبول های قرمز و کاهش کاذب هماتوکریت )
لخته شدن قسمتی از نمونه ( وجود لخته های ریز و کوچک در نمونه )
غلیظ بودن نمونه به علت استفاده طولانی از تورنیکت (بیش از یک دقیقه)
همولیز نمونه
بیش از حد گرم شدن یا منجمد کردن نمونه
نمونه ی خون کهنه
خطا در برداشت نمونه توسط دستگاه
خطا در شست و شوی اولیه و آماده سازی دستگاه ( سبب شمارش زمینه ای بالای شمارنده در زمان شروع کار می شود )
عدم اختلاط کافی نمونه قبل از تحویل نمونه به دستگاه شمارنده سلول
انسداد مسیر مکش دستگاه ( توسط لخته که از نمونه قبلی باقی مانده است )
تداخل نمونه بسیار غیر طبیعی قبلی با نمونه فعلی
نقص اولیه در دستگاه
حجم نا کافی نمونه
خطا در کالیبراسیون
استفاد از مواد کنترلی به عنوان کالیبراتور
خطا در تعیین دقیق مقادیر پارامتر ها برای روش کالیبراسیون
خطای خروج از کالیبراسیون ( خروج از کالیبر شمارنده به دلیل سرویس عمومی دستگاه، تعویض قطعه کلیدی، تعویض سری ساخت معرف ایزوتون یا سایر معرف ها
عدم صحت اندازه گیری دستگاه به دلیل ماهیت برخی برخی روش های اندازه گیری که برای دستگاه طراحی شده
تعیین میزان MCV کمتر از مقدار واقعی در صورت وجود گلبول های قرمز هیپوکروم در دستگاه های امپدانس
ناتوانی شناسایی سلول ها در صورت کمبود آنزیم پراکسیداز، در برخی از دستگاه ها
عدم صحت عملکرد دستگاه به دنبال ویژگی خاص در نمونه
خطا در تعیین میزان هموگلوبین و اندکس های گلبولی به دلیل وجود آگلوتینین های سرد یا افزایش چربی خون
نوتروپنی کاذب در صورت کمبود آنزیم پراکسیداز، در برخی از دستگاه ها
چند مثال از منابع خطای ناشی از افزایش غلظت ضد انغقاد EDTA
الف- چروکیدگی گلبولهای قرمز و کاهش کاذب هماتوکریت به روش دستی (املاح دی‌پتاس اثرات چروکیدگی سلولی کمتری نسبت به املاح تری‌پتاس دارا می‌باشند).
ب- ترومبوسیتوپنی کاذب به دلیل چسبندگی پلاکت‌ها به جدار خارجی نوتروفیل‌ها / ترومبوسیتوزیس کاذب به دلیل شکستن و لیز پلاکت‌ها به قطعات کوچک‌تر
ج- تبدیل پلاکت از حالت دیسکوئید به کروی و افزایش حجم پلاکت د- خون حاوی ضد انعقاد حداکثر در مدت 6 ساعت پس از نمونه‌برداری بایستی آنالیز گردد/ تهیه گسترش خونی بهتر است همزمان با نمونه‌برداری یا حداکثر 1 ساعت پس از نمونه‌برداری صورت گیرد تا کمترین تغییرات مرفولو‍ژیک حاصل گردد
اجزای اصلی سل کانتر
سل کانتر معمولا از سه بخش اصلی هیدرولیک، پنوماتیک و الکترونیکی تشکیل می شود.
وظایف سیستم هیدرولیک:
وظایف سیستم هیدرولیک شامل برداشت محلول های مورد نیاز دستگاه و نمونه خون یا Aspirating، تخلیه محلول ها یا خون برداشت شده یاDispensing، رقیق سازی نمونه یا Diluting، مخلوط کردن نمونه و محلولها یا Mixing و افزودن محلول لیز کننده به نمونه یا Lysing است.
وظایف سیستم پنوماتیک:
وظیفه اصلی سیستم پنوماتیک تولید خلاء یا فشار ثابت جهت کنترل دریچه ها و همچنین کنترل حرکت محلول ها و نمونه در داخل سیستم هیدرولیک است.
وظایف سیستم الکترونیکی:
این سیستم توسط یک ریز پردازنده (میکروپروسسور) کنترل می شود و وظایف زیر را به عهده دارد:
- اندازه گیری و پردازیش سیگنال های حاصل از تغییر امپدانس
- محاسبه و انتقال نتایج به چاپگر با هر خروجی دلخواه در سیستم
- ترسیم گراف پارامترهای اصلی
- کنترل زمان اندازه گیری و توالی تست ها
- اجرای برنامه Q.C و کالیبراسیون سیستم
- ذخیره و بازیابی (Save and Load) نتایج
سایر مزایای این دستگاهها
این دستگاهها با رنگ آمیزی پراکسیداز گلبولهای سفید، گلبول های نرمال را از غیرنرمال افتراق می دهند. این دستگاه ها با استفاده از رنگ آمیزی گرانولهای داخل سلولی نوع گلبولهای سفید را دقیقا افتراق (Diff) نموده و درصد آنها را بیان می نمایند. مقدار سلولهای نارس یا بلاست(Blast) را نشان می دهند که برای تشخیص لوسمی ها و لنفوم ها وکم خونی ها بسیار حائز اهمیت می باشد. برخی از آنها رتیکولوسیت را نیز می شمارند که در مانیتورینگ کم خونی مهم است.